1.2.1 样品的预处理
各厂各采样点的样品先经冷冻干燥(-56 ℃,50 Pa)24 h以上,至含水率低于5%,取冷干样品研磨,过80目(0.2 mm)筛网,弃去筛上物(主要为污泥中的杂质或残余辅料),筛下物收集,依次放入密封袋中并编号,避光干燥保存。
1.2.2 有机质的测定
腐殖酸和蛋白质的提取与测定:采用焦磷酸钠碱溶酸析法提取腐殖酸,具体步骤为:称取0.5 g冷干的污泥粉末,置于250 mL具塞锥形瓶中,加入100 mL焦磷酸钠与氢氧化钠混合提取剂(0.1 mol/L Na4P2O7和0.1 mol/L NaOH),室温下浸提14 h,浸提液为腐殖酸与蛋白质的混合液;量取50 mL浸提液,通过酸碱调节(用2 M H2SO4调浸提液pH<3,80 ℃水浴30 min,此时有沉淀析出,室温下静置12 h,沉淀用0.45 μm滤膜过滤,滤液为富里酸,滤纸上的沉淀再用0.1 M NaOH重新溶解为胡敏酸),分离出富里酸和胡敏酸,并分别定容至100 mL,最后采用修正后的lowry法测定腐殖酸和蛋白质的浓度。
多糖的提取与测定:称取0.1 g冷干污泥粉末,置于10 mL哈希比色管中,加入5 mL 2.5 M HCl,旋紧瓶盖,置于哈希消解仪中,100 ℃下消解3 h,冷却至室温,加固体碳酸钠中和液体(约0.6 g),直到泡腾停止;用蒸馏水定容至50 mL,过0.45 μm滤膜,采用蒽酮-硫酸法测定滤液中的多糖浓度。
1.2.3 三维荧光光谱的测定与分析
蛋白质类和腐殖酸类物质是具有荧光特性的有机物,三维荧光(3D-EEM)图谱能定性或半定量地分析这两类物质的相对含量,从而将蛋白质的减量和腐殖酸的增量耦合起来。三维荧光图谱采用三维荧光光谱仪(FluoroMax-4,Horiba,日本)测定。光谱数据使用Origin 8.5软件进行绘图,并使用ImageJ软件(https://imagej.nih.gov/ij/)对光谱图进行半定量分析。以牛血清蛋白、富里酸和胡敏酸标准物质的荧光图谱作为参照,分析样品出峰位置所代表的荧光物质。
对3D-EEM光谱的定性分析通过荧光区域整合法(Fluorescence Regionalization Integration,FRI)进行。早期有学者将荧光光谱分为5个区;后续有研究者将荧光光谱进一步划分为七类荧光区。在本研究中,参照七类荧光分区法,将三维荧光图谱进一步归类为2个区:复杂有机物区和简单有机物区;复杂有机物区包括类富里酸、类胡敏酸以及腐殖化中间产物,简单有机物区包括类蛋白质以及蛋白质中间代谢产物。
参考Muller等的方法,在FRI法的基础上,借助Origin和ImageJ软件对光谱图进行半定量分析。首先,将得到的彩色光谱图转化为黑白图,再利用ImageJ软件读取各区域的面积和荧光信号强度。根据式(1)计算各区域的荧光值:
Vf(i)=VimageJ(i)×∑2i=1S(i)S(i)(1)
式中 S(i)——区域面积;
VimageJ(i)——区域内荧光信号强度。
根据式(2)计算出的值称为荧光复杂指数(Complexity Index, CI),即类腐殖酸与类蛋白荧光值的比值。
CI=Vf(2)Vf(1)(2)
CI指数反映了复杂有机物与简单有机物含量的比值,一定程度上反映了物料中易生物降解组分(蛋白质类物质)的减少和复杂、稳定组分(腐殖质类物质)的增加。该指数越大,说明简单有机物降解越彻底,有机物腐殖化程度越高,也说明样品的化学性质越稳定。